Em um laboratório, uma equipe compara a região promotora de um gene em duas amostras de células humanas. No…

Questão

Em um laboratório, uma equipe compara a região promotora de um gene em duas amostras de células humanas. No sequenciamento após tratamento convencional com bissulfito, citosinas sem modificação são convertidas, enquanto 5-metilcitosinas e 5-hidroximetilcitosinas permanecem lidas como citosinas. As duas amostras apresentam sinais semelhantes nesse teste, mas a equipe precisa saber se cada modificação ocorre em proporções diferentes. Qual procedimento permite distinguir, nessa região, as 5-metilcitosinas das 5-hidroximetilcitosinas?

1. A) Analisar a quantidade total de RNA da amostra, que identifica qual das duas modificações está presente em cada citosina.
2. B) Usar PCR quantitativa com iniciadores para a região, que quantifica separadamente citosinas metiladas e hidroximetiladas.
3. C) Repetir o sequenciamento com bissulfito convencional em mais moléculas, que separa as duas modificações pela frequência de citosinas.
4. D) Realizar sequenciamento após oxidação com bissulfito, que permite distinguir 5-metilcitosina de 5-hidroximetilcitosina.
5. E) Imunoprecipitar histonas associadas ao promotor, que revela se cada citosina possui metilação ou hidroximetilação.

✅ Resposta correta: alternativa D

Resolução passo a passo

1. O bissulfito convencional converte citosinas não modificadas em uracila, mas a 5-metilcitosina e a 5-hidroximetilcitosina continuam lidas como C. Por isso, no sequenciamento convencional, as duas modificações aparecem juntas e não se separam. Passo 2: Para distinguir as duas, é preciso um tratamento que atue de forma diferente sobre cada uma. Na oxidação com bissulfito (oxBS-seq), a 5-hidroximetilcitosina é oxidada a 5-formilcitosina antes da conversão, que a transforma em uracila (lida como T). A 5-metilcitosina não é oxidada e continua lida como C. Passo 3: Comparando o sequenciamento convencional com o oxidado, uma posição que aparece como C nas duas condições corresponde a 5-metilcitosina. Uma posição que aparece como C no convencional e como T no oxidado corresponde a 5-hidroximetilcitosina. Assim, é possível quantificar cada modificação na região promotora. Passo 4: A alternativa A está errada, porque a quantidade de RNA total não informa modificações químicas das citosinas do DNA. Passo 5: A alternativa B está errada, porque a PCR quantitativa mede a quantidade de DNA amplificado e não diferencia a natureza química de cada citosina. Passo 6: A alternativa C está errada, porque repetir o bissulfito convencional mantém a mesma limitação, já que 5-metilcitosina e 5-hidroximetilcitosina continuam indistinguíveis. Passo 7: A alternativa E está errada, porque a imunoprecipitação de histonas trata de modificações nas histonas e não da metilação ou hidroximetilação das citosinas do DNA. Passo 8: O gabarito D está correto e coincide com a resolução feita independentemente.

💡 Dica: Focar em métodos que diferenciem 5-metilcitosina e 5-hidroximetilcitosina.

Alternativa por alternativa

Raio-X da questão

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