Utilizando Danio rerio como modelo, proponha um protocolo experimental para investigar como uma redução…

Questão

Utilizando Danio rerio como modelo, proponha um protocolo experimental para investigar como uma redução parcial da sinalização de Nodal (genótipo N+/n, sendo n um alelo hipomórfico) altera os eventos de gastrulação e a determinação de linhagens celulares. Descreva passos experimentais, controles, previsões fenotípicas em cada estágio (clivagem, blastulação, gastrulação, neurulação), técnicas de análise e possíveis implicações para gametogênese e fertilidade.

✍️ Questão dissertativa: veja abaixo a resposta esperada e a explicação.

Resposta esperada

Protocolo: 1) Geração de embriões N+/n por cruzamento de progenitores ou redução parcial de Nodal por morfolino/CRISPRa com dose limitada; incluir irmãos N+/N+ como controle e resgate com RNA mensageiro de Nodal. 2) Cronograma: fertilização ? clivagem ? blastulação ? gastrulação ? neurulação; acompanhar por timelapse. 3) Marcadores e técnicas: sondas de ISH para goosecoid (nó/anterior), no tail/tbx6 (mesoderme), sox2 (neuroectoderme); injeção de traçadores fluorescentes para fate mapping; imunomarcação e imagem confocal para movimentos celulares; qPCR para níveis de transcritos. 4) Predições fenotípicas: clivagem e blastulação geralmente normais; durante gastrulação, movimentos convergência e extensão reduzidos, menor indução de mesoderme (?tbx6, goosecoid), expansão relativa de ectoderme (?sox2), resultando em defeitos axiais e falha parcial de neurulação. Resgate com mRNA de Nodal deve atenuar fenótipo. 5) Análises quantitativas: porcentagem de embriões com cada defeito, intensidade de sinal de marcadores, estatística de comparação com controles. 6) Implicações para gametogênese/fertilidade: defeitos de padrão corporal e insuficiente formação de tecidos gonadais podem levar a redução da formação de gônadas funcionais e subfertilidade em adultos; análises longitudinais de indivíduos sobreviventes e histologia gonadal são recomendadas. Controles éticos: minimizar número de embriões, justificar uso e seguir protocolos de bem-estar animal.

Explicação

O protocolo apresentado abrange de forma abrangente as etapas experimentais necessárias para investigar os efeitos da sinalização de Nodal na gastrulação e na determinação celular, incluindo controles adequados e métodos de análise. As previsões fenotípicas são bem fundamentadas, relacionando alterações esperadas em cada estágio do desenvolvimento com a função do Nodal. Além disso, as implicações para a gametogênese e fertilidade demonstram uma compreensão das consequências biológicas mais amplas do estudo, refletindo um planejamento experimental sólido e ético.

Raio-X da questão

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